PCR ללא הפקת DNA – אבחנה מהירה תוך-ניתוחית 

מתקצר: פרופ' מרדכי רוזנר

מחלות זיהומיות מהוות איום משמעותי על בריאות הציבור. חשוב לזהות במהירות ובדייקנות גורמי זיהום שעלולים לגרום לתוצאות קליניות קשות או למוות. פתוגנים מסוימים עלולים לגרום לזיהומים בעיניים שעלולים להסתיים בעיוורון.

 Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) ו- multiplex polymerase chain reaction (PCR)  משמשים לזיהוי אובאיטיס במסגרת מחקרים, אולם עדיין אין סטנדרטיזציה של פרוטוקולים ופרימרים ולא פותח קיט PCR אוניברסלי לשימוש קליני. בנוסף, בדיקות אלה אורכות זמן, לא מתאימות לצרכי אבחון מהיר תוך-ניתוחי, ומצריכות בודקים מיומנים.

המטרה של החוקרים הייתה לפתח בדיקת PCR אבחנתית, אמינה, זולה וניתנת לביצוע ללא צורך בבודקים מנוסים, ואשר מצריכה דגימות זעירות.

במחקר קודם הם הדגימו אב טיפוס של solid-phased multiplex real-time PCR prototype (Strip PCR) אשר זיהה 24 פתוגנים של מחלות עיניים זיהומיות ב- 772 דגימות מעיניים. הבדיקה בוצעה ברצועה טובולרית של 8 או 12 בארות מצופות בפרימרים השונים, ולא היה צורך בבודקים מנוסים. זמן ביצוע הבדיקה היה 5 דקות ו- 58 שניות לבדיקת 24 פתוגנים, בהשוואה לבדיקות המקובלות שאורכות 10 ו-41 דקות לפתוגן אחד ומצריכות בודקים מיומנים. ה-Strip PCR עבר אופטימיזציה ל-9 הפתוגנים השכיחים ביותר באובאיטיס.

יש לו הבט כמותי שיכול לשמש להערכת חומרת המחלה. בדיקות אחרות כמו Verigene או FilmArray לא מסוגלות למדוד את ה- DNA copy number של פתוגנים והם מצריכים ציוד יקר.

הנוזלים התוך עיניים מכילים מעכבי PCR בדומה לנוזלי גוף אחרים, והצמיגות של הזגוגית עלולה למנוע ביצוע PCR ישיר. אי לכך יש צורך בהפקה של DNA לפני בדיקת PCR. בדיקת Strip PCR, בדומה לבדיקות אחרות, כוללת שלב של הפקת DNA, אשר מאריך את זמן ההכנות ב- 40 עד 60 דקות גם במערכת אוטומטית. אתגר אחר בבדיקת PCR היה הטיפול בנפחים זעירים (20-30 מיקרוליטר) של הדגימות מהעיניים. בגלל הקושי בהפקת DNA מנוזלי העין קשה השאיפה היא להימנע מכך.

במחקר הנוכחי פותח קוקטייל ראגנטים חדש ובוצעו חידושים טכנולוגיים עבור בדיקות של מי לשכה וזגוגית ללא צורך בשלב הפקת DNA. הבדיקה החדשה כונתה direct multiplex real-time PCR test (Direct Strip PCR). המחקר לבדיקת השיטה בוצע ב- 19 מוסדות בכל העולם.

החוקרים היו מיפן: ממחלקת העיניים של האוניברסיטה של Oita, מהמרכז לתאי אב ורפואה רגנרטיבית וממחלקת העיניים  של האוניברסיטה לרפואה ורפואת שיניים בטוקיו, מבית החולים לעיניים Miyata, ממחלקת העיניים של בית החולים לעיניים של העיר Kobe, ומהמעבדה לרגנרציה של הרשתית במרכז RIKEN למחקר דינמיקה ביו-סיסטמית ב- Kobe.

במחקר נבדקה היכולת של הבדיקה החדשה לזהות 9 פתוגנים של אובאיטיס בדגימות של 20 מיקרוליטר. המחקר היה רב מרכזים ופרוספקטיבי וכלל 511 משתתפים שכללו חולים עם אובאיטיס וקבוצת ביקורת מ- 18 מוסדות ברחבי העולם.

התוצא העיקרי היה ההתאמה בין תוצאות הבדיקה החדשה לבין התוצאות של qPCR.

התוצאות הראו ש- Direct Strip PCR מאפשר זיהוי מהיר, הדירות וספציפיות טובים, יציבות ארוכת זמן באכסון,  ויכולת אבחון שווה ל- qPCR.  נמצאה שונות נמוכה בין המוסדות השונים, גם כאשר בודקים לא מנוסים השתמשו במכונות ה- PCR השונות. בדיקה זו עבור 9 הפתוגנים הייתה בהתאמה של 98.8-100% עם התוצאות החיוביות והשליליות של qPCR. המסקנה הייתה שבדיקות PCR חדשות אלה עשויות לשפר את הפרוגנוזה של מחלות זיהומיות כיוון שהן מאפשרות אבחנה מהירה של הגורם הזיהומי בביקור הראשון בבית החולים או בעת ניתוח.